Činnost zahájila Galerie Rudolfinum v obnovených prostorách 1. ledna 1994. Programově se věnuje současnému výtvarnému umění s občasnými průhledy do minulosti. Výlučná orientace na výstavy (galerie nemá vlastní sbírky) a spolupráce v mezinárodním kontextu formuje Galerii Rudolfinum do podoby otevřeného komunikačního prostoru. K tomu přispívá i další činnost v rámci výstavních projektů: vydávání katalogů a publikací, organizování přednášek, seminářů a četných doprovodných programů, hudebních a filmových přehlídek. Důležitou složkou je také edukativní a lektorská práce. Velkoryse architektonicky koncipované výstavní sály velké galerie doplňují tři sály malé galerie, vhodné zejména pro komorní výstavy a různé další projekty (např. promítání, workshopy či speciální instalace).
V Galerii Rudolfinum se setkává současné umění s historickou neorenesanční architekturou budovy Rudolfina. Propojení výtvarného umění s hudbou a dalšími uměleckými projevy skýtá možnost nevšedních kulturních zážitků.
